糖尿病泛素化(泛素化需要消耗能量吗)

• 1、何庆教授：千头万绪一“线”牵，「线粒体糖尿病」的诊治要点 | 世界罕见病日
• 2、糖高血糖素受体的泛素化状况决定信号倾向
• 3、聚焦肥胖的病因和机制，探索新的可能干预靶点| EASD2024

何庆教授：千头万绪一“线”牵，「线粒体糖尿病」的诊治要点 | 世界罕见病日

导读：2022年2月28日是第15个“世界罕见病日”，今年的主题是“分享你的生命色彩（Share Your Colours）”，生命的华彩并不因罕见病而黯淡，只会因为非凡而绽放出独特的璀璨光芒。

借此机会，分享天津医科大学总医院内分泌代谢科何庆教授有关“线粒体糖尿病诊疗”的精彩学术报告。何教授结合病例为大家梳理了线粒体糖尿病的诊治要点，并强调，线粒体病“千头万绪”，全面认识才能“牵出线头”。

专家介绍

何庆教授

个人简介：医学博士、美国路易斯安大州立大学博士后，主任医师、博士生导师；天津医科大学总医院内分泌代谢科副主任；中华医学会内分泌学分会垂体学组委员；中华医学会内分泌学分会罕见病学组委员；国家医学考试中心医师资格考试临床专家委员会委员；天津市医学会糖尿病分会副主任委员；天津市医师协会内分泌代谢科医师分会副会长；天津市糖尿病防治协会常务理事；天津中西医结合学会内分泌分会委员；参获天津市科技进步一等奖、天津市科技进步二等奖、天津市自然科学三等奖各一次；主持天津市科委重点项目、天津市自然科学基金项目和天津市二十一世纪青年科学基金项目各一项；参加国家自然科学基金项目四项；参编学术著作六部；已在国内外医学期刊发表论文80余篇。

线粒体病“千头万绪”，一切根源在于mtDNA百种突变

1.认识线粒体病，需从认识线粒体开始

线粒体是一种两层膜包被的细胞器，是细胞有氧呼吸的主要场所，亦被称为“power house”，提供全身约95%的三磷酸腺苷（ATP）。大多数真核细胞都拥有线粒体，不过在大小、数量以及外观等方面不同细胞的线粒体有所不同。

线粒体DNA突变是人类疾病的重要病因：Anderson（1981）测定人类线粒体DNA（mtDNA）全长序列，Holt（1988）首次从线粒体病患者中发现mtDNA缺失，证实mtDNA突变是人类疾病的重要病因，建立了有别于孟德尔遗传的线粒体遗传的新概念。

线粒体DNA有哪些特殊之处？细胞核基因组为二倍体，每条染色体都只有2个同源拷贝（一条来自于父方，一条来自于母方）；而线粒体基因组为多倍体，其基质内包含1-10个相同的线粒体DNA分子。线粒体中的拷贝数量不同，每个细胞中的线粒体数量也不同，这对突变的表型表达具有重要影响。

线粒体DNA是一个双链的闭环分子，由16,569对碱基对组成，编码13个多肽，均为呼吸链的组成部分。然而，每个线粒体约有1700种基因产物，包括200多种呼吸链蛋白。因此，线粒体中的绝大多数基因产物都是由细胞核DNA编码。线粒体有其自己的DNA转录和RNA翻译机制。除13个多肽基因外，线粒体DNA还编码22个转运RNA和2个核糖体RNA，共37个线粒体基因。线粒体DNA的遗传密码与细胞核DNA的通用遗传密码稍有不同。

线粒体DNA不同于核DNA的6个特征：

➤突变率——氧自由基的损伤和缺少组蛋白使线粒体DNA的突变率很高。已得到报道的线粒体DNA突变有200多种。

➤母系遗传——线粒体DNA最突出的特征之一是母系遗传。在卵母细胞的受精过程中，精子仅携带少量线粒体，约为卵母细胞的1/100。此外，父系线粒体会在随后的细胞分裂和有丝分裂分离中被稀释，并且部分父系线粒体可能成为泛素化的目标并因此遭到破坏。

➤异质性——每个线粒体都具有数个DNA分子，而每个细胞都具有数百个线粒体。正常状态下，所有线粒体DNA分子都相同（同质性）。致病性突变一般仅存在于部分线粒体DNA拷贝中，而非所有拷贝（异质性）。异质性可发生于单个线粒体、细胞或某种组织。

➤阈值效应——考虑到程度不一的异质性，某一组织的细胞并非都出现异常。因此，在发生呼吸链衰竭和细胞功能异常之前必须出现最低所需数量的突变DNA。临床征象只有在足量的细胞受累之后才会变得明显。这种现象被称为阈值效应。

➤有丝分裂分离——在细胞分裂的过程中，细胞器随机分配，这就会导致细胞中的突变DNA量发生改变并超过阈值。随后本来未受累的组织中就会发生临床表型改变。

➤有丝分裂后复制——线粒体DNA的复制与细胞周期无关。这就会使得终末分化细胞（如，神经元或肌肉）在特定刺激下（运动，代谢需求增加）发生有丝分裂后的线粒体DNA复制。这就解释了为什么有些组织本来没有症状，但后来病变超出了症状阈值。

2.线粒体病的危害具有多面性

何教授指出，根据主要涉及的遗传缺陷，线粒体病可分为以下几类病因：呼吸链蛋白、呼吸链辅助蛋白、线粒体RNA翻译、线粒体内膜脂质环境、线粒体DNA减少、线粒体动力学。线粒体病可表现出多种临床表型，能量需求高的组织（即脑、心、骨骼肌）优先受累。骨骼肌受累则称为线粒体肌病；脑和骨骼肌均受累则称线粒体脑肌病。

其中，线粒体病对于内分泌系统的影响：

➤下丘脑垂体：生长发育迟缓、低促性腺激素性性腺功能减退、继发性肾上腺功能不全、中枢性甲减。

➤甲状旁腺：原发性甲旁减；

➤甲状腺：原发性甲减；

➤肾上腺：原发性肾上腺皮质功能减退；

➤胰腺：线粒体糖尿病、外分泌胰腺功能下降；

➤卵巢：卵巢早衰；

➤睾丸：高促性腺激素性性腺功能减退症。

线粒体病对于人体其他方面的损害：

➤神经系统损害主要表现有：眼外肌麻痹、中青年人卒中、癫痫发作、肌阵挛、视神经病、肌病、神经性耳聋、共济失调、痴呆、周围神经病、肌张力障碍、脑脊液蛋白升高等。

➤其它系统损害表现为：心脏传导阻滞、心肌病、母系遗传糖尿病、身材矮小、甲状腺功能低下、视网膜色素变性、白内障、乳酸酸中毒、近端肾小管功能缺陷、肾小球疾病、肝病、小肠假性梗阻、发作性呕吐、全血细胞减少、胰腺功能失调及精神性疾病（特别是抑郁）、肿瘤等。

线粒体糖尿病——众多线粒体病中的一种

1.什么是线粒体糖尿病？

线粒体糖尿病（mitochondrial diabetes mellitus，MDM）是指由于线粒体功能缺陷引起的糖尿病，属于特殊类型糖尿病，包括线粒体基因突变型糖尿病和核基因突变型糖尿病，归属于B细胞遗传缺陷性糖尿病，也有学者称之为“Maternally inherited diabetes and deafness（MIDD）”。

1992年，Ballinger首先报道了线粒体DNA的10.4kb的丢失导致糖尿病的1个家系。同年van den Ouweland发现另1家系的糖尿病是线粒体基因的异常即第3243位点A→G的点突变引起，二人分别确认线粒体糖尿病由线粒体基因突变引起。从此世界各地陆续有该基因突变致糖尿病的病例报道。

全球范围，MDM约占糖尿病总数3%，线粒体基因突变引起的MDM占中国糖尿患者的0.6%~1.8%，目前尚缺乏针对核基因突变引起的MDM在中国人群中的发病率数据。

2.线粒体糖尿病的病因及发病机制

➤胰岛素分泌障碍或不足：线粒体氧化磷酸化功能受损的胰岛β细胞，其ATP生成不足，导致钙离子通道的开放受到抑制，从而出现胰岛素分泌障碍；线粒体功能异常时，ROS生成过多，导致胰岛细胞凋亡增多，使得胰岛β细胞绝对数量减少，因而造成胰岛素分泌不足。

➤胰岛素抵抗：线粒体功能障碍时，损伤线粒体内高氧自由基浓度状态，会激活压力敏感的蛋白激酶，这些蛋白激酶会对IRS-1进行丝氨酸磷酸化和S-亚硝基化，同时会相应减少对IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化修饰，抑制胰岛素信号通路，这些负面作用将导致肝脏、骨骼肌和脂肪组织出现对胰岛素的抵抗。

线粒体病的广泛危害，透过病例可见一斑

1.现病史

患者史某某，男，22岁，2021年2月3日入院，主诉：活动耐量差10余年，发作左侧肢体无力1年余，发现血糖升高2月。患者原于10余年前上学时，体育课长跑及其他有氧运动成绩均不达标，未予重视。后逐渐发现较同龄人身高生长缓慢，无身高蹿长，无变声、胡须生长，无晨勃、遗精，有少量阴毛、腋毛生长。

2019年08月，就诊于我院儿科，检查结果如下，考虑原因不明的先天性垂体功能不足，予以治疗。

2019年11月，患者出现一般活动状况下出现左侧肢体无力症状，左上肢不能持物，左下肢行走费力，无头晕头痛、无恶心呕吐、无胸闷憋气，无饮食饮水呛咳等症状，到我院急诊科就诊，检查结果如下。

➤垂体半剂量增强MRI：未见确切异常

➤头MR（2019-11-16我院急诊）：

1.头部右侧基底节-丘脑区梗塞；

2.双侧基底节区软化灶；

3.双侧基底节对称性T1WI高信号，结合CT为钙化，建议甲状旁腺功能检查；

4.双侧筛窦、上颌窦、左侧额窦炎，双侧上颌窦粘膜囊肿。

➤头CT（2019-11-18我院急诊）：未见明显出血；

考虑线粒体脑肌病，进行基因检测，结果见下图，确诊MELAS综合征（线粒体脑肌病），予以治疗。

➤治疗：住院期间予达贝，必存清除氧自由基，长春西汀改善循环，韦迪抑酸护胃治疗，易善复改善肝功能，甲钴胺片营养神经，予以B族维生素、辅酶Q10、L-精氨酸治疗，优甲乐补充治疗等，症状好转，未存留后遗症。

➤出院后坚持用药：艾地苯醌 1片口服TID，L-精氨酸 1粒口服BID，辅酶Q10 1片口服QD1片口服TID，维生素B1 1片口服TID，维生素B2 1片口服TID，维生素C500mg口服QD，左卡尼丁口服液10ml口服BID，ATP 1片口服TID，左甲状腺素钠片75ug口服QD，多烯磷脂酰胆碱胶囊228mg口服TID。

什么是MELAS综合征？MELAS综合征为线粒体DNA突变引起的母系遗传性多系统疾病。此综合征的特征为出现脑卒中样发作，导致轻偏瘫、偏盲或皮质盲。其他常见特征包括局灶性或全面性癫痫发作、复发性偏头痛样头痛、呕吐、身材矮小、听力损失以及肌无力。许多tRNA突变可引发MELAS，但是该疾病80%的病例与m.3243A＞G突变相关，10%与m.3271 T＞CtRNA突变相关。

1年余前，患者卒中样发作后逐渐出现听力减退明显，2月余前于天津市第四中心医院完善纯音测听检查，提示听力减退，高频听力受损为著。

2月余前，发现空腹血糖升高，6.54mmol/L，空腹胰岛素28.80mIU/L，无多饮、多尿、多食易饥。现为进一步治疗收治入院。患者自本次发病以来，精神尚可，食欲正常，睡眠尚可，大便如常，小便如常，近1年余体重增加约15kg。

其他病史：

➤既往史：否认高血压病史。否认冠心病病史。否认传染病史。预防接种史按规定。无手术史。无外伤史。否认输血史。否认药物过敏史，否认食物过敏史。

➤个人史：否认吸烟史、饮酒史。

➤婚育史：未婚、未育。

➤家族史：父亲健在，母亲健在，母亲27岁妊娠期发现血糖升高，后诊断为“糖尿病”，目前应用诺和灵30R 20-24iu BID治疗，血糖控制一般，空腹血糖7-8mmol/L；母亲子宫小，月经稀发，备孕期间注射黄体酮人工周期治疗；外祖母50岁后诊断糖尿病。

体格检查：

体温36.5℃ 脉搏 106次/分 呼吸 18次/分 血压 142/86mmHg，神志清醒，口齿清晰。全身皮肤粘膜无黄染，浅表淋巴结无肿大，颈软，无抵抗感。鸡胸，听诊双肺呼吸音清音，双肺未闻及湿啰音、干啰音，未闻及哮鸣音，心率106次/分，律齐，杂音未闻及，腹部平坦，腹部无压痛，无反跳痛，肝脏未及，脾脏未及，双下肢无浮肿。双侧足背动脉搏动可触及。左侧肘关节、腕关节、左手指关节背伸稍差，生理反射正常，左侧Babinski征阳性。

专科查体：身高165cm，体重60kg，BMI22.12kg/cm2。上部量75cm，下部量90cm，指间距168.5cm。皮肤细腻，颈部及腋下皮肤黑棘皮样变，鸡胸，唇周少量绒毛，腋毛少，阴毛Tanner4期，阴茎牵长7cm，双侧睾丸体积均10ml。

汇总病例特点：

1.青年男性；

2.慢性病程，进行性加重；

3.活动耐量差→生长发育障碍→卒中样发作→听力减退→血糖升高；

4.家族史：母亲糖尿病、听力减退、子宫小；

5.查体异常：下部量＞上部量，第二性征发育不全，鸡胸，黑棘皮样变，病理征阳性。

辅助检查结果见下表。

目前诊断：线粒体糖尿病；线粒体脑肌病、乳酸酸中毒、卒中样发作综合征（MELAS）；低促性腺激素性性腺功能减退症；生长激素缺乏；肝功能异常；脂肪肝；高脂血症；高尿酸血症。

何教授指出，线粒体病会对身体多个组织器官造成损害，就此病例来看，患者曾到儿科、神经科就诊，线粒体糖尿病甚至已经不是患者主要诉求，应重视疾病的早期筛查和诊断。

线粒体糖尿病的诊断、筛查与治疗

何教授指出，线粒体糖尿病早期诊断具有多项意义：（1）临床医师可以给予有针对性的治疗；（2）对于其他临床并发症（如耳聋、神经肌肉病等）可尽早给予筛查及治疗；（3）对于其家系内的其他高风险成员予以遗传咨询指导，尽早进行筛查；（4）对于有生育要求的女性患者，可以基于产前诊断技术，如胚胎植入前检测，为其提供相应优生优育的指导。

MDM的诊断：

对于满足以下3个条件的患者，可确诊为MDM；对于仅满足前两个条件的患者，无法确定糖尿病是否继发于线粒体功能缺陷时，建议给予糖尿病伴线粒体功能缺陷诊断：

1.糖尿病确诊患者；

2.经细胞功能学验证存在线粒体功能缺陷；

3.有明确的基因突变，含已报道突变及经细胞学功能验证的新突变。

MDM的鉴别诊断：

MDM的筛查对象：

建议对评分≥4分的患者进行MDM筛查，评分项目如下：

➤发病年龄＜40岁的2型糖尿病患者（1分）；

➤非肥胖体型的2型糖尿病患者（1分）；

➤胰岛相关抗体检测阴性（1分）；

➤伴神经性听力受损（1分）；

➤伴其他多系统临床表现，如中枢神经系统病变、心肌病、骨骼肌肌力减低、视网膜色素变性、眼外肌麻痹、乳酸酸中毒等（2分）；

➤病程短，病程中出现胰岛β细胞分泌功能进行性减退，较快出现口服药物失效而需胰岛素治疗者（2分）；

➤在家系内糖尿病的传递符合母系遗传（3分）。

MDM的治疗：

早期建议规范使用胰岛素治疗以保护胰岛β细胞功能、延缓各种糖尿病急慢性并发症的出现；避免使用二甲双胍以防止可能出现的致命的乳酸酸中毒。

糖高血糖素受体的泛素化状况决定信号倾向

胰腺α细胞分泌的多肽激素胰高血糖素以及被胰高血糖素激活的B类七跨膜G蛋白偶联受体在调节血糖水平方面发挥了基础性的作用。胰高血糖素能够激活两种B类GPCR，即胰高血糖素受体和胰高血糖样肽1受体。这两种受体都在胰岛β细胞中表达，并能够在胰高血糖素刺激下促进胰岛素的分泌，GLP-1R对胰高血糖素的激活效力较GCGR低。

受体调节胰岛素释放的能力已将GLP-1R和GCGR确立为治疗2型糖尿病的重要靶点。分泌的胰高血糖素作用于肝细胞中的GCGR，不仅能够增强葡萄糖产生，还调节氨基酸和脂质代谢。

评估了胰高血糖素受体的泛素化状态对其信号特性的影响。将GCGR-5KR（五个泛素化位点突变）与野生型GCGR进行比较，观察它们在受体激活后与Gs蛋白的耦合以及环状腺苷酸3',5'-单磷酸的产生能力。相对于GCGR-WT，GCGR-5KR的cAMP生成能力显著降低，其EC50右移5倍，最大响应减少3倍。这并不是由于受体表达差异所致。

GCGR-5KR还导致了对cAMP/蛋白激酶A途径中的磷酸化反应的减弱。在Gs激活方面存在缺陷，GCGR-5KR与内源性β-阻滞素的结合增强，而β-阻滞素参与了GPCR的脱敏和内化以及MAP激酶的信号传导。与GCGR-WT相比，GCGR-5KR更强烈地激活p38 MAPK信号通路。GCGR的不同泛素化状态导致其信号传导的差异，泛素化状态下的GCGR显示出降低的cAMP生成和减弱的Gs耦合能力，但与β-阻滞素的结合和p38 MAPK的活化增强。

GCGR的泛素化状态与其信号转导能力之间存在联系。当GCGR处于去泛素化状态时，它更容易与β-阻滞素结合，并激活p38 MAPK，但与Gs蛋白的耦合较差。

评估GCGR中五个赖氨酸残基（K169、K333、K406、K423或K451）在泛素化过程中的作用，生成并测试了五个不同的GCGR突变体。突变体中的每一个都将一个赖氨酸突变为精氨酸。除了GCGR-K333R外，其他突变体在胰高血糖素刺激下表现出与野生型GCGR相似的去泛素化模式。GCGR-K333R突变体在基线状态下显示明显减少的泛素化，但在胰高血糖素刺激后没有进一步减少。各个GCGR单赖氨酸突变体在细胞膜上表达正常，并与野生型GCGR相当。

与其他突变体相比，GCGR-K333R在胰高血糖素诱导的cAMP积累方面显示出降低的药效和最大效应值下降30%。与cAMP反应的减弱相反，GCGR-K333R引发了比其他突变体更强烈的p38 MAPK活化。GCGR的赖氨酸333位点是在基线状态下被泛素化的关键位点，并在激动剂刺激后发生去泛素化。在去泛素化状态下，GCGR有望促进强力的p38 MAPK信号传导。

进一步评估了GCGR的泛素化状态对信号传导的影响。通过将GCGR的五个潜在泛素化位点之一的赖氨酸突变为精氨酸，其中GCGR-K333R突变体在基线状态下显示出明显减少的泛素化，并且在胰高血糖素刺激后没有进一步的泛素化减少。而其他四个赖氨酸突变体在胰高血糖素刺激后都能够快速发生去泛素化，重现了野生型GCGR的模式。

与GCGR-WT相比，表达GCGR-K333R的细胞中，胰高血糖素诱导的cAMP积累显著降低。药效降低（GCGR-K333R的EC50增加了6倍）和最大效应值下降了30%。这表明GCGR的泛素化状态直接影响其与G蛋白的活化。

在cAMP反应受到削弱的情况下，GCGR-K333R却引发了比GCGR-WT和其他单赖氨酸突变体更强烈的p38 MAPK活化。GCGR-K333R的信号偏向更加倾向于激活p38 MAPK通路。GCGR的泛素化状态对其信号传导具有重要影响。Lys333被标记为泛素化位点，该位点在基线状态下进行泛素化，并在激动剂刺激后发生去泛素化。直接影响了GCGR的G蛋白耦合和p38 MAPK活化能力。

确定GCGR的泛素化状态是否影响其与G蛋白复合物和β-arrestin同源体的相互作用，利用了最近开发的增强旁观型生物发光共振能量转移实验。使用了标记有Renilla Luciferase的mini-Gs和β-arrestin，并评估它们在表达野生型或突变型GCGR的HEK-293细胞中，对激动剂诱导的rGFP标记的质膜标记物的转位情况。

在表达GCGR-K333R或GCGR-5KR的细胞中，激动剂浓度依赖性的mini-Gs向质膜的转位显著受损，与表达GCGR-WT或其他所有赖氨酸突变体的细胞相比，胰高血糖素促进mini-Gs转位的药效和最大效应值均降低。推测在GCGR处于去泛素化状态时，与mini-Gs的结合受到削弱。

评估了在表达GCGR-WT或每个GCGR赖氨酸突变体构建的HEK-293细胞中，β-arrestin1-RLucII和rGFP-CAAX以及β-arrestin2-RLucII和rGFP-CAAX之间的激动剂诱导的BRET。GCGR-K333R和GCGR-5KR，其与mini-Gs的耦合受损，显示出比GCGR-WT或其他GCGR单赖氨酸突变体更强的β-arrestin1和β-arrestin2的招募。这反映出胰高血糖素促进其转位到质膜的药效和最大效应值的增加。在去泛素化状态下，GCGR更易于与β-arrestin结合，而Gs蛋白的耦合减弱。

β-阻抗素是一种多功能的适配蛋白，它不仅可以阻断G蛋白的耦合，还能促进GPCR的内吞作用，并作为传播和定位MAPK活性的支架。尽管两个β-阻抗素同源体在GPCR失活和转运中具有相似的功能和结构，但它们在信号转导中可能扮演不同的角色。为了确定它们在激活p38 MAPK中的贡献，研究使用小干扰RNA靶向每个同源体的基因表达，分析对GCGR诱导的p38 MAPK磷酸化的影响。

在沉默β-阻抗素1的条件下，GCGR刺激引起的p38 MAPK活化显著降低。在β-阻抗素1存在的情况下，沉默β-阻抗素2几乎没有影响。在相同实验样品中测试了GCGR诱导的CREB磷酸化水平，无论是沉默β-阻抗素1还是β-阻抗素2都不会影响CREB的活化。验证这些发现是否适用于其他模型系统，研究还在肠促胰岛素反应性细胞系832/3中测试了每个β-阻抗素同源体的沉默效率。在INS-1细胞中，沉默β-阻抗素1几乎完全抑制了GCGR诱导的p38 MAPK活性。β-阻抗素1选择性地促进GCGR诱导的p38 MAPK活性，而β-阻抗素2在该信号通路中似乎没有主要作用。

p38 MAPK通过涉及至少两个顺序作用的其他激酶的级联磷酸化事件来激活。第一步是激活十个潜在MAP3K之一，可以进一步磷酸化和激活三个潜在MAP2K之一，导致p38 MAPK的磷酸化。当被激活时，MAP2K直接磷酸化p38的激活环上的Thr和Tyr残基，导致构象变化，从而激活激酶。

在哺乳动物细胞中表达的三个MAP2K中，即MKK3、MKK4和MKK6，MKK3是一种常用的上游激酶，专门靶向p38的激活。p38 MAPK还通过一种非经典机制被激活，该机制不依赖于MAP2K，并涉及到TGF-β激活的蛋白激酶1 (TAK1)结合蛋白1与p38 MAPK的结合而触发自磷酸化。

β2AR激动剂刺激诱导的p38 MAPK活性呈现双相性。初始激活的p38 MAPK依赖于β-阻抗素1，而后期阶段则依赖于G蛋白/cAMP/PKA信号通路。为了进一步了解GCGR激活p38 MAPK的机制，研究使用siRNA静默PKAα和PKAβ的表达。

PKA亚型的表达被还原到80-85%的水平，但与对照siRNA转染的细胞相比，激动剂诱导的p38 MAPK活化显著增加。预处理细胞使用PKA抑制剂6-22后，p38 MAPK的磷酸化水平增加了约35%。cAMP/PKA通路可能对GCGR诱导的p38 MAPK活性具有抑制作用。

在相同的PKA敲低实验中，还测试了GCGR诱导的CREB活性是否依赖于PKA表达。PKAα的静默导致胰高血糖素诱导的CREB活化减少约40%，而PKAβ的敲低没有降低CREB活性。PKA抑制剂也显著降低GCGR激动剂诱导的CREB活化。推测在HEK-293细胞中，PKA活性可能阻碍GCGR诱导的p38 MAPK活性，并且PKAα参与了GCGR诱导的CREB活化。

βarr最初被发现时，它们具有阻断G蛋白耦联和减弱GPCR激活引发的第二信使响应的能力。解析βarr1和βarr2在抑制GCGR诱导的cAMP生成中的作用，采用了一种增强功能的方法，在βarr1/2缺失背景下重新表达各个βarr来进行重构。还使用相应的亲本细胞评估具有内源性βarr的细胞中的cAMP响应。

与亲本细胞中生成的cAMP相比，CRISPR βarr1/2 KO细胞中的信号显著增加，从E-max的增加可以看出；在恢复了βarr表达的KO细胞中，cAMP生成与亲本细胞中的模式非常相似。还确认了所有样品中内源性和外源性βarr以及GCGR-WT的表达。βarr1和βarr2在抑制由GCGR激活引发的G蛋白介导的cAMP信号传导中具有冗余作用。

在HEK-293细胞中观察到的泛素驱动信号偏好是否适用于与生理相关的系统，利用腺病毒在β细胞系832/3中表达了GCGR-WT或GCGR K333R。使用大鼠胰岛素启动子控制的腺病毒载体，实现了基因的表达。成像和Western blotting检测，GCGR-WT和GCGR-K333R在转导效率和蛋白表达水平方面是相等的。在具有内源性GCGR的INS-1 β细胞中，利用对照腺病毒感染的细胞进行胰高血糖素刺激，观察到对p38 MAPK的轻微响应以及CREB磷酸化水平的约1.5倍增加。

与GCGR-WT相比，外源性的GCGR-K333R显著增强了p38 MAPK的活化。GCGR-K333R引起的CREB磷酸化显著降低，而不是GCGR-WT引起的CREB磷酸化（图7A，C）。这些结果证实了在HEK-293细胞中观察到的GCGR K333R偏好于p38 MAPK信号传导而不是Gs/PKA信号传导的偏好耦合在β细胞中也普遍存在。

两种βarrs都可以有效地被招募到GCGR上，并且这两种亚型都能传递多种GPCR所促进的MAPK活化；限制GCGR介导的p38 MAPK活化选择性为βarr1的机制可能是由信号复合体组装的蛋白质的内在性质所致。分析了在胰岛素刺激下，两种βarr亚型通过蛋白质框架对p38 MAPK和MKK3的支架活性是否不同。从表达GCGR-WT或GCGR-K333R的HEK-293细胞中免疫沉淀HA标记的βarr1和βarr2，带有或不带有激动剂刺激，并分析磷酸化p38、p38和MKK3的结合情况。

βarr1但不是βarr2成为GCGR-WT激活的磷酸化p38的高效支架。在GCGR激活时，β-arr1与磷酸化p38形成复合物，但未检测到β-arr2的激动剂促进相互作用。对表达GCGR-K333R的细胞进行的免疫沉淀实验清晰地显示了βarr1支架活性的差异。不仅检测到磷酸化p38与βarr1的结合比与βarr2更强，而且GCGR-K333R激活后，βarr1明显显示了增加的激动剂诱导与未磷酸化的p38以及MKK3的结合。就像GCGR-WT激活一样，GCGR-K333R激活减少了βarr2与形成p38 MAPK支架的上述组分的关联。在与GCGR结合形成其去泛素化状态时，βarr1假定了一种激活构象，使其成为专一而有效的支架，以传递p38 MAPK信号。

参考文献

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聚焦肥胖的病因和机制，探索新的可能干预靶点| EASD2024

编者按：在当今全球健康领域，肥胖问题已成为不容忽视的严峻挑战。随着生活方式的改变和饮食结构的变化，肥胖人数急剧攀升。肥胖不仅影响个人形象，更是糖尿病、心血管疾病、癌症、神经退行性疾病和精神疾病等的重要危险因素，也给社会医疗体系造成了沉重负担。因此，深入研究肥胖的成因及调节机制对于预防和治疗肥胖及其相关疾病具有至关重要的意义。在2024年EASD年会上，法国波尔多大学Magendie神经中心的Daniela Cota教授、加拿大马斯特大学代谢、肥胖和糖尿病研究中心的Gregory R. Steinberg教授和圣地亚哥德孔波斯特拉大学生理学系的Ruben Nogueiras教授围绕肥胖的成因及机制这一主题分享了自己的研究成果。本刊撷取三位教授主题演讲的重点内容与读者分享。

下丘脑对能量过剩的反应在能量平衡调节中的作用

法国波尔多大学Magendie神经中心的Daniela Cota教授介绍了能量过剩时下丘脑对能量平衡的调节及相关研究。她表示，大脑对能量过剩的反应是一个复杂的过程，涉及能量存储、使用以及营养、激素和神经信号等多个方面，具体表现为大脑结构、功能的变化以及大脑与外周的交互改变。已有研究取得了一些重要发现。例如，基质辅助激光解析电离质谱（MALDI） 技术揭示了饮食对大脑成分的影响，在普通饮食和高脂饮食下，下丘脑的磷脂等成分含量发生变化，且高脂饮食16周后恢复普通饮食，大脑成分有一定程度的逆转[1]。

小胶质细胞作为大脑的免疫细胞，在大脑生理过程中发挥着关键作用（图1），包括突触重塑、神经元功能、髓鞘形成等，还参与监视、吞噬、释放可溶性因子，并参与炎症、组织修复、血脑屏障通透性和血管生成等。高脂高糖饮食会诱导炎症，短期高脂饮食喂养会改变小胶质细胞与神经元的相互作用以及下丘脑小胶质细胞激酶活性。其中，mTORC1作为代谢变阻器，在高脂饮食诱导下丘脑小胶质细胞激酶活性切换中发挥重要作用，并且小胶质细胞的mTORC1会促进肥胖的发生发展[2-4]。

图1. 小胶质细胞在大脑生理过程中发挥着关键作用

另外，胆汁酸被发现是一种新的外周到大脑的调节信号。减重手术后，患者的循环胆汁酸升高。饮食诱导的肥胖会改变下丘脑胆汁酸-TGR5系统。而研究表明，下丘脑胆汁酸-TGR5信号传导对预防肥胖具有保护作用[5]。

类泛素化修饰对葡萄糖代谢的调节

圣地亚哥德孔波斯特拉大学生理学系的Ruben Nogueiras教授在演讲中介绍了类泛素化修饰（Neddylation）在葡萄糖代谢调节中的作用及相关研究。蛋白质翻译后的修饰对于细胞功能和生理过程的调控至关重要，其中类泛素化修饰作为一种重要的修饰过程受到了广泛关注。类泛素化修饰是指神经前体细胞表达发育下调基因8（NEDD8）与靶蛋白共价结合的过程[6]。该过程涉及一系列酶的参与，包括NEDD8激活酶（E1）、NEDD8结合酶（E2）以及底物特异性酶（E3）。NEDD8会与多种蛋白质结合，进而影响它们的功能，因此，在癌症治疗领域，抑制类泛素化修饰被视为一个潜在的靶点[7]。

在葡萄糖代谢方面，肝脏中的类泛素化修饰呈现出一些有趣的变化。当禁食24小时后，肝脏的类泛素化修饰增加，表现为NAE1、Cullins、NEDD8等蛋白的水平升高。同样，在热量限制的情况下，也观察到了肝脏的类泛素化修饰增加。进一步研究发现，在热量限制条件下，抑制类泛素化修饰能够降低葡萄糖水平，但却不改变葡萄糖耐量或胰岛素敏感性。

Ruben Nogueiras教授介绍，类泛素化修饰对于血糖调节激素也有重要影响（图2）。在肾上腺素诱导的高血糖情况下，抑制类泛素化修饰可以减少血糖升高；对于糖皮质激素诱导的高血糖，抑制类泛素化修饰同样能够起到降低血糖的作用。此外，在2型糖尿病患者中，类泛素化修饰呈现升高的状态，具体表现为NAE1和NEDD8蛋白水平的升高，以及相关蛋白表达的改变，并且这些变化与疾病的严重程度存在一定的相关性。

图2. Neddylation对血糖调节激素有重要影响

在类泛素化修饰与葡萄糖代谢的相关研究中，还涉及到了关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）。Ruben Nogueiras教授表示，PCK1是葡萄糖生成的关键酶，类泛素化修饰会导致PCK1的结构发生变化。在功能方面，野生型PCK1能够恢复肝细胞中PCK1的活性，然而三重突变型PCK1（K278R-K342R-K387R）则无法恢复PCK1的活性，在PCK1肝脏免疫缺陷小鼠中，三重突变型PCK1也不能恢复葡萄糖水平。

生长分化因子15（GDF15）：新兴生物学和治疗应用

加拿大马斯特大学代谢、肥胖和糖尿病研究中心的Gregory R. Steinberg教授分享了GDF15在体重调节与能量代谢中的作用及其研究进展。在全球肥胖及糖尿病、心血管疾病等相关疾病日益严峻的大背景下，体重调节机制的研究显得愈发关键。GDF15在这一领域崭露头角，其作用及相关研究备受关注。

体重减轻时机体会出现能量消耗适应性降低的情况，这为体重维持带来了挑战，GDF15在其中扮演着重要角色[8]。其作用机制主要是通过与受体GFRAL结合，抑制食物摄入，并可能通过GFRAL-βAR信号通路刺激能量消耗（图3）[9]。这一过程涉及下丘脑神经元活动的调节，如ARC核中神经元相关信号分子的变化，进而影响胃排空、食物偏好等，最终实现减少能量摄入和降低肥胖发生的效果。

图3. GDF15可以预防能量消耗降低

多项实验研究进一步揭示了GDF15的作用特点。与热量限制相比，慢性GDF15干预在高脂和果糖饮食的小鼠研究中表现更优，能更大程度降低体重，促进脂肪组织优先减少，改善胰岛素敏感性，且能防止能量消耗降低，无论上午还是下午喂食，都能促进能量消耗和体重减轻，同时抑制食欲。然而，GDF15促进体重减轻并非通过棕色脂肪组织，而是通过增强骨骼肌中控制无效循环和脂肪酸氧化的转录程序，增加肌肉中钙刺激的氧消耗，以及阻止肌肉能量消耗减少来实现。

不过，Gregory R. Steinberg教授也表示，关于GDF15的研究还有一些关键问题尚待解决。例如，慢性GDF15干预治疗是否比单独热量限制更大程度降低体重的长期效果和适用范围仍需明确；GDF15维持能量消耗的具体作用组织还不完全清楚，尽管已发现其对骨骼肌的作用，但仍可能涉及其他组织的协同作用；GDF15的生理配体也有待进一步研究。

此外，GDF15与其他因素也存在关联。如它与AMPK激活剂等相关，可能参与葡萄糖、脂质代谢调节，二甲双胍等药物可能通过相关途径影响GDF15。同时，口服脂肪酸如油酸、亚油酸、亚麻酸等可增加GDF15表达，尤其是亚麻酸可增加肾脏GDF15表达，并在不同肾脏组织部位有不同的表达变化。

总结

要揭示肥胖的成因和机制涉及多个层面和领域的研究。Daniela Cota、Ruben Nogueiras和Gregory R. Steinberg三位教授在2024年EASD年会上分别介绍了能量过剩时下丘脑对能量平衡的调节机制，包括小胶质细胞在其中的关键作用以及胆汁酸作为新的外周到大脑的调节信号，GDF15在体重调节与能量代谢中的重要作用以及类泛素化修饰在葡萄糖代谢调节中的作用等。这些研究为我们深入理解肥胖的成因及调节机制提供了重要线索，也为未来制定肥胖及相关疾病的治疗和预防策略奠定了基础，但仍需要进一步的研究和探索来完善相关理论和应用。

参考文献

1.Sighinolfi G, et al. Sci Rep. 2021 Oct 4;11(1):19664.

2.Paolicelli RC, et al. Neuron. 2022 Nov 2;110(21):3458-3483.

3.Thaler JP, et al. J Clin Invest. 2012 Jan;122(1):153-62.

4.Valdearcos M, et al. Cell Metab. 2017 Jul 5;26(1):185-197.e3.

5.Castellanos-Jankiewicz A, et al. Cell Metab. 2021 Jul 6;33(7):1483-1492.e10.

6.Zhao Y, et al. Antioxid Redox Signal. 2014 Dec 10;21(17):2383-400.

7.Zheng YC, et al. J Hematol Oncol. 2021 Apr 7;14(1):57.

8.Gerstein HC, et al. Diabetes Care. 2017 Feb;40(2):280-283.

9.Yang L, et al. Nat Med. 2017 Oct;23(10):1158-1166.