糖尿病模型小鼠(糖尿病模型小鼠的制备及血糖检测)

• 1、“人工胰岛”是否可行？科学家在小鼠研究模型上首获成功
• 2、山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室：关于糖尿病小鼠模型皮肤创面愈合的实验方法
• 3、突破性进展！美国科学家用新型生物墨水3D打印出人类胰岛，为治疗Ⅰ型糖尿病带来新希望【附3D打印行业市场分析】

“人工胰岛”是否可行？科学家在小鼠研究模型上首获成功

新华社上海3月21日电(记者张建松)糖尿病是威胁人类健康的主要慢性疾病之一，由于胰岛β细胞功能失常导致胰岛素分泌不足，许多患者需要终生使用胰岛素进行治疗。能否利用自身的成体干细胞，在体外造一个“人工胰岛”？科学家在小鼠研究模型上首次获得了成功。

中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的曾艺研究组，在实验小鼠中开展实验，成功鉴定出小鼠胰岛中的干细胞类群，并借助干细胞体外培养的方法，获得了有功能的小鼠“人工胰岛”(胰岛类器官)，为下一步人体“人工胰岛”的研究提供了理论依据和技术支持。

据介绍，研究人员在寻找胰岛中成体干细胞的过程中，在实验小鼠身上发现了一群新的细胞类别“Procr 细胞”。实验证明，这群“Procr 细胞”是小鼠胰岛中的成体干细胞，可以分化形成胰岛的全部细胞类型。

为进一步把小鼠体内的发现转化成为体外的应用，研究人员建立了一种Procr 胰岛干细胞与血管细胞共培养的3D培养体系，成功获得了有功能的小鼠胰岛类器官。

在体外“复刻”的“人工胰岛”，包含胰岛所有的细胞类型，与真正的小鼠胰岛，在功能、形态等方面都非常相似。当研究人员把这些“类器官”移植到糖尿病小鼠模型体内，小鼠的血糖水平恢复，糖尿病病征减轻。

业内专家认为，该研究首次鉴定了小鼠胰岛中成体干细胞的“身份”，回答了长期以来“成体胰岛是否存在干细胞”这一争议性问题，是干细胞基础研究的重大突破。这项工作建立的小鼠胰岛类器官培养体系，为将来能在体外获得大量有功能的人的胰岛β细胞，开拓了新的思路。

不过，需要特别强调的是，目前的研究成果，还只是在小鼠模型上取得了成功。人体的胰岛中是否也存在成体干细胞？是否也能在体外培养成胰岛？还有待进一步的探索和研究。

这项研究获得科技部、国家自然科学基金委、中科院、上海市科委等单位科研经费的支持。相关研究论文19日在国际知名学术期刊《细胞》上发表。

来源：新华网

山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室：关于糖尿病小鼠模型皮肤创面愈合的实验方法

负载人脐带间充质干细胞的水凝胶对糖尿病小鼠皮肤创面愈合的疗效

1山西医科大学生理学系，细胞生理学教育部重点实验室，山西省太原市 030001；

2中国医学科学院血液病医院/中国医学科学院血液学研究所，天津昂赛细胞基因工程有限公司/细胞产品国家工程研究中心，天津市 300041；

3出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室，山西医科大学生物化学与分子生物学系，山西省太原市 030001

实验方法
1 氯化壳聚糖-β-甘油磷酸钠水凝胶的制备

称取0.4 g氯化壳聚糖粉末溶于20 mL DMEM/F12培养基中，冰浴下600 r/min充分搅拌，得到质量分数为2%的氯化壳聚糖溶液，性状为均一的淡黄色胶冻状液体，记为A液；称取4.5 g β-甘油磷酸钠粉末于10 mL DMEM/F12培养基中，冰浴下600 r/min充分搅拌，用0.22 µm滤器过滤除菌，得到质量分数45%的β-甘油磷酸钠溶液，性状为淡红色清亮液体，记为B液；冰浴下，将5 mL B液逐滴加入600 r/min搅拌下的20 mL A液中，继续搅拌，使其充分混匀，调节pH值至7.35-7.45，得到温敏性氯化壳聚糖-β-甘油磷酸钠溶液，4 ℃保存备用。

2 人脐带间充质干细胞在水凝胶中的种植、培养 将1.4.1制备的水凝胶溶液加入24孔板中，每孔1 mL，放入37 ℃恒温烘箱中使其成胶待用。室温下，将培养至第3代的人脐带间充质干细胞重悬于DMEM/F12完全培养基中，调整细胞浓度为2×107 L-1，接种于水凝胶上，每孔1 mL细胞悬液，对照组人脐带间充质干细胞用完全培养基培养，置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中分别培养1，3，5 d，使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖率，根据吸光度值(450 nm)绘制生长曲线。

3 1型糖尿病模型小鼠的构建

C57小鼠适应性喂养1周左右，通过腹腔注射现配的链脲佐菌素溶液(0.01 mL/g)，连续注射5 d，每次注射前禁食不禁水12 h；在第6，7天连续2 d采用尾静脉采血方式测量空腹小鼠血糖值，选择血糖高于11 mmol/L的小鼠纳入实验。

4 小鼠背部皮肤创面模型的构建

经链脲佐菌素注射液致高血糖的小鼠随机分为3组：生理盐水对照组、水凝胶组、复合水凝胶组，每组5只。小鼠经异氟烷吸入麻醉后，固定于手术台上，用体积分数为75%乙醇消毒背部皮肤，除去背部的毛发，确定伤口位置和大小，在小鼠背部用打孔器打一个直径为8 mm的圆形创面，切除皮肤全层。

5 水凝胶敷胶治疗

把孵育完成的水凝胶、负载人脐带间充质干细胞的复合水凝胶切成直径约1 cm、高约5 mm的圆柱体敷在小鼠背部创面上，医用纱布固定，对照组给予等量生理盐水治疗。术后单独喂养，每天对小鼠进行观察，每3 d更换1次新的敷料以确保敷料的完整性，并测量体质量、血糖。

6 创面的形态学观察

根据术后第1，7，14天获得的照片确定每个糖尿病小鼠创面的大小，并通过Image J软件分析各组小鼠的创面愈合率。收集3组小鼠皮肤伤口样本，其中一部分组织用于制备石蜡切片，一部分组织用于提取RNA。

7 苏木精-伊红染色

在敷胶治疗后的第7，14天，沿着小鼠伤口外缘剪取约5 mm的组织标本，固定脱水后，石蜡包埋，切片厚度5 μm，按文献[20]中步骤进行苏木精-伊红染色：脱蜡、脱水，苏木素染色5 min，自来水冲洗，分化液分化30 s后在自来水中浸泡15 min，伊红染液染色2 min，自来水中浸泡5 min，切片梯度乙醇脱水，透明及封固。用显微镜观察皮肤组织形态学变化，Image J软件统计分析肉芽组织新生率。

8 Masson染色

将石蜡切片脱蜡至水，铁苏木素染色8 min，酸性乙醇分化液分化10 s，自来水冲洗1 min，Masson蓝化液返蓝4 min，蒸馏水冲洗1 min，丽春红品红染色液染色8 min，弱酸(2%乙酸溶液)工作液冲洗1 min，磷钼酸溶液洗1.5 min，弱酸工作液冲洗1 min，苯胺蓝染色液染色1.5 min，弱酸工作液冲洗1 min，体积分数为95%乙醇、无水乙醇脱水3次，每次10 s，二甲苯透明3次，每次2 min，中性树胶封固，显微镜下观察。

9 CD31、CD45免疫组织化学染色

将石蜡切片脱蜡，PBS冲洗2次，每次10 min，在98 ℃预热的EDTA抗原修复液中加热20 min后冷却至室温，PBS冲洗3次，每次10 min，内源性过氧化物酶避光孵育20 min，PBS冲洗3次，每次10 min，孵育anti-CD31/anti-CD45(1∶100)一抗4 ℃过夜，第2天室温孵育30 min，PBS冲洗3次，每次10 min，二抗反应增强液避光孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，二抗避光孵育1 h，PBS冲洗3次，每次10 min，DAB显色液显色，PBS冲洗1次，每次5 min，苏木素染液染色35 s，蒸馏水冲洗1 min，分化液分化反应3 s，PBS冲洗，体积分数为80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇各脱水2次，每次5 min，二甲苯透明2次，每次2 min，中性树胶封固，显微镜下观察。

10 免疫荧光染色

将石蜡切片脱蜡后用体积分数为5%正常山羊血清封闭1 h，4 ℃下孵育一抗：兔来源一抗anti-CD68(1∶200)和鼠来源一抗anti-CD86(1∶200)用于鉴定M1型巨噬细胞，兔来源一抗anti-CD68(1∶200)和鼠来源一抗anti-CD206(1∶200)用于鉴定M2型巨噬细胞，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min，加入对应的荧光二抗(1∶200)，避光孵育 1 h，PBS清洗，滴加DAPI避光孵育20 min，荧光显微镜采集图像。

11 qRT-PCR检测创面中白细胞介素10、白细胞介素6的mRNA水平

敷胶治疗后的第7，14天，采用Trizol法提取皮肤伤口组织中的总RNA，检测RNA的浓度与纯度，反转录为cDNA，按照两步法PCR扩增程序进行Real-time PCR反应，β-actin作为内参。目的基因的相对表达量采用 2-ΔΔCT法计算，引物序列，见表1。

主要观察指标

① 各组小鼠创面的愈合情况；

② 各组小鼠创面组织中血管新生和炎症反应；

③ 各组小鼠创面局部胶原沉积和血管再生情况；

④ 各组小鼠创面局部肉芽组织的形成情况；

⑤ 各组小鼠创面中白细胞介素10、白细胞介素6的mRNA水平。

信息来源：中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (1): 21-27

突破性进展！美国科学家用新型生物墨水3D打印出人类胰岛，为治疗Ⅰ型糖尿病带来新希望【附3D打印行业市场分析】

近日，美国维克森林大学领衔的国际研究团队在生物打印领域实现重大突破——利用新型生物墨水3D打印出功能性人类胰岛，为治疗Ⅰ型糖尿病带来了新希望。这项成果在2025年欧洲器官移植学会大会上首次发布，被视为再生医学领域的重要成果。

胰岛是胰腺中负责分泌胰岛素等激素的细胞群，对于调节血糖水平至关重要，其功能缺陷是Ⅰ型糖尿病的根源。糖尿病患者由于胰岛功能受损，需要通过外部注射胰岛素来控制血糖。3D打印技术在生物医学领域的应用为胰岛移植和糖尿病治疗提供了新的可能性。

传统治疗依赖外部注射胰岛素，而胰岛移植因供体短缺和免疫排斥问题难以普及。此次研究中，团队采用海藻酸盐与脱细胞人类胰腺组织制成的定制生物墨水，结合CELLINK® BIOX 3D生物打印机，成功打印出高密度、结构稳定的三维胰岛。实验显示，这些人工胰岛在体外保持高细胞存活率，胰岛素分泌功能正常;植入糖尿病模型小鼠后，90天内血糖水平持续稳定，治疗效果显著。

此次突破不仅为解决胰岛供体短缺提供了方案，更验证了定制生物墨水的普适性——其结合天然聚合物的生物相容性与脱细胞外基质的结构支撑性，为组织工程和再生医学提供了新范式。未来，患者或可通过个性化3D打印获得“量身定制”的胰岛组织，彻底改变糖尿病治疗模式。

3D打印行业是一种革命性的制造技术领域，被视为未来制造业的重要发展方向之一。通过逐层叠加材料实现数字模型实体化，其革命性在于突破传统制造的复杂结构限制，并大幅降低定制化成本。近年来，该技术从工业制造向医疗、航空、建筑等领域渗透，成为全球制造业升级的核心驱动力。

在医疗领域，3D打印已应用于假肢定制、骨骼修复甚至器官芯片开发。此次胰岛打印的成功，标志着生物3D打印从“结构复制”迈向“功能再生”，为复杂器官构建奠定基础。

加州理工学院医学工程教授高伟认为，未来在人工智能的帮助下，有望实现运动器官中自主触发高精度打印，为复杂病症的治疗带来新的希望。不过，要将体内3D打印技术应用于临床实践，仍需克服在复杂人体环境中实现精准定位和打印，以及提高生物墨水的安全性和有效性等挑战。

目前，全球3D打印产业竞争激烈，中国虽起步较晚，但通过“十四五”规划对关键核心技术的重点布局，已实现后来居上。根据工信部的统计数据，2023年，中国3D打印产业规模达400亿元，同比增长25%。

前瞻产业研究院认为，随着3D打印产品在已有场景中应用规模进一步扩张，以及新场景、新应用的不断开拓，预计2029年中国3D打印设备的市场规模将超1200亿元，2024-2029年复合年均增长率约为19.5%。

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